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組織培養(tissue culture)技術是指分離一個或數個體細胞或植物體的一部分進行培養的技術。植物組織培養即植物無菌培養技術,又稱離體培養,是根據植物細胞具有全能性的理論,利用植物體離體的器官(如根、莖、葉、莖尖、花、果實等)、組織(如形成層、表皮、皮層、髓部細胞、胚乳等)或細胞(如大孢子、小孢子、體細胞等)以及原生質體,在無菌和適宜的人工培養基及溫度等人工條件下,能誘導出愈傷組織、不定芽、不定根,最后形成完整的植株的學科。 



 組織培養類型


組織培養按培養對象可分為組織或愈傷培養、器官培養、植株培養、細胞和原生質體培養等。一是組織或愈傷組織培養tissue, callus culture為狹義的組織培養,是對植物體的各部分組織進行培養,如莖尖分生組織、形成層、木質部、韌皮部、表皮組織、胚乳組織和薄壁組織等等;或對由植物器官培養產生的愈傷組織進行培養,二者均通過再分化誘導形成植株。二是器官培養organ culture即離體器官的培養,根據作物和需要的不同,可以包括分離莖尖、莖段、根尖、葉片、葉原基、子葉、花瓣、雄蕊、雌蕊、胚珠、胚、子房、果實等外植體的培養。三是植株培養(plant culture是對完整植株材料的培養,如幼苗及較大植株的培養。四是細胞培養(cell culture是對由愈傷組織等進行液體振蕩培養所得到的能保持較好分散性的離體單細胞或花粉單細胞或很小的細胞團的培養。原生質體培養(protoplast culture)是用酶及物理方法除去細胞壁的原生質體的培養。



 組織培養特點


組織培養是本世紀發展起來的一門新技術,由于科學技術的進步,尤其是外源激素的應用,使組織培養不僅從理論上為相關學科提出了可靠的實驗證據,而且一躍成為一種大規模、批量工廠化生產種苗的新方法,并在生產上越來越得到廣泛的應用。一是培養條件可以人為控制。組織培養采用的植物材料完全是在人為提供的培養基質和小氣候環境條件下進行生長,擺脫了大自然中四季、晝夜的變化以及災害性氣候的不利影響,且條件均一,對植物生長極為有利,便于穩定地進行周年培養生產。二是生長周期短,繁殖率高。植物組織培養是由于人為控制培養條件,根據不同植物不同部位的不同要求而提供不同的培養條件,因此生長較快。另外,植株也比較小,往往20-30d為一個周期。所以,雖然植物組織培養需要一定設備及能源消耗,但由于植物材料能按幾何級數繁殖生產,故總體來說成本低廉,且能及時提供規格一致的優質種苗或脫病毒種苗。三是管理方便,利于工廠化生產和自動化控制。植物組織培養是在一定的場所和環境下,人為提供一定的溫度、光照、濕度、營養、激素等條件,極利于高度集約化和高密度工廠化生產,也利于自動化控制生產。四是未來農業工廠化育苗的發展方向。它與盆栽、田間栽培等相比省去了中耕除草、澆水施肥、防治病蟲害等一系列繁雜勞動,可以大大節省人力、物力及田間種植所需要的土地。


 

 組織培養的發展

 

萌芽階段:組織培養技術的蓬勃發展只是近50年的事,但它的整個歷史可以追溯至19世紀末和上世紀初。20世紀初,在SchleidenSchwann所發展起來的細胞學說的推動下,1902年德國植物學家Haberlandt提出了高等植物的器官和組織為許多細胞組成的觀點,以及植物細胞全能性的理論,即植物的體細胞,在適當的條件下,具有不斷分裂和繁殖,發育成完整植株的潛在能力。他首次發表了植物離體細胞培養實驗的報告。1912年,Habefiandt的學生Kotte和美國的Robins根尖培養中獲得了組織培養的成功。


奠基階段:Haberlandt的實驗之后,直到1934年美國的White由番茄根建立了第一個活躍生長的無性繁殖系,并反復轉移到新鮮培養基中繼代培養,使根的離體培養實驗獲得了真正的成功,并在以后28年間培養了1600代。這之后,White又以小麥根尖為材料,研究了光、溫度、通氣、pH值、培養基組成等各種培養條件對生長的影響,并于1937年建立了第一個組織培養的綜合培養基,其成分均為已知化合物,包括3B族維生素,即吡哆醇、硫胺素和煙酸,該培養基后來被定名為White培養基。與此同時,Gautherer1934)在研究山毛柳和黑楊等形成層的組織培養實驗中,提出了B族維生素和生長素對組織培養的重要意義,并于1939連續培養胡蘿卜根形成層獲得首次成功。


發展階段:1940年代Skoog和崔徵在煙草莖切段和髓培養以及器官形成的研究中發現,腺嘌呤或腺苷可以解除培養基中生長素(IAA)對芽形成的抑制作用,而能誘導形成芽,從而明確了腺嘌呤與生長素的比例是控制芽和根形成的主要條件之一。1952MorelMartin通過莖尖分生組織的離體培養,從已受病毒侵染的大麗花中首次獲得無病毒植株。19351945Muir把單細胞放在一張鋪在愈傷組織上面的濾紙上培養,使細胞發生了分裂,即實施了看護接種技術,使單細胞培養獲得初步成功。1960年,Cocking等人用真菌纖維素酶分離植物原生質體獲得成功。1971年,Takebe等在煙草上首次由原生質體獲得了再生植株,這不僅在理論上證明了無壁的原生質體同樣具有全能性,而且在實踐上為外源基因的導入提供了理想的受體材料。1962年印度Guha等人成功地在毛葉曼陀羅花藥培養中,由花粉誘導得到單倍體植株,從而促進了花藥和花粉培養的研究。以后相繼在煙草、水稻、小麥、玉米、番茄、辣椒、草莓、蘋果等多種植物培養中獲得成功,其數目達到160多種,其中煙草、水稻和小麥等的花藥育種培養在中國取得了引入注目的成就


 

 組織培養的過程


材料采集:組織培養所用的材料非常廣泛,可采取根、莖、葉、花、芽和種子的子葉,有時也利用花粉粒和花藥,其中根尖不易滅菌,一般很少采用。 對于木本花卉來說,闊葉樹可在一、二年生的枝條上采集,針葉樹種多采種子內的子葉或胚軸,草本植物多采集莖尖。在快速繁殖中,最常用的培養材料是莖尖,通常切塊在0.5厘米左右,如果為培養無病毒苗而采用的培養材料通常僅取莖尖的分生組織部分,其長度在0.1毫米以下。


材料消毒:先將材料用流水沖洗干凈,最后一遍用蒸餾水沖洗,再用無菌紗布或吸水紙將材料上的水分吸干,并用消毒刀片切成小塊。 在無菌壞境中將材料放入70%灑精中浸泡3060秒。 再將材料移入漂白粉的飽和液或0.1%升汞水中消毒10分鐘。 取出后用無菌水沖洗三、四次。 


制備外植體:將已消毒的材料,用無菌刀、剪、鑷等,在無菌的環境下,剝去芽的鱗片、嫩枝的外皮和種皮胚乳等,葉片則不需剝皮。然后切成0.20.5厘米厚的小片,這就是外植體。在操作中嚴禁用手觸動材料。

 

接種和培養:在無菌壞境下,將切好的外植體立即接在培養基上,每瓶接種410個。 接種后,瓶、管用無菌藥棉或蓋封口,培養皿用無菌膠帶封口。 培養基大多應保持在25℃左右,但要因花卉種類及材料部位的不同而區別對待。 外植體的增殖是組培的關鍵階段,在新梢等形成后為了擴大繁殖系數,需要繼代培養。把材料分株或切段轉入增殖培養基中,增殖培養基一般在分化培養基上加以改良,以利于增殖率的提高。增殖1個月左右后,可視情況進行再增殖。 繼代培養形成的不定芽和側芽等一般沒有根,必須轉到生根培養基上進行生根培養。1個月后即可獲得鍵壯根系。 


練苗移栽:從無菌到光、溫、濕穩定的環境進入自然環境,試管必須進行煉苗。一般移植前,先將培養容器打開,于室內自然光照下放3天,然后取出小苗,用自來水把根系上的營養基沖洗干凈,再栽入已準備好的基質中,基質使用前最好消毒。移栽前要適當遮蔭,加強水分管理,保持較高的空氣濕度(相對濕度98%左右),但基質不宜過濕,以防爛苗。


 

 組織培養的應用

 

植物組織培養成為生物科學的一個廣闊領域,除了在基礎理論的研究上占有重要地位以外,還在農業生產中也得到越來越廣泛的應用。 


快速繁殖:用植物組織培養的方法進行快速繁殖(rapidpropagation)是生產上最有潛力的應用,包括花卉觀賞植物、蔬菜、果樹、大田作物及其他經濟作物。快繁技術不受季節等條件的限制,生長周期短,而且能使不能或很難繁殖的植物進行增殖。通過莖尖、莖段、鱗莖盤等產生大量腋芽;通過根、葉等器官直接誘導產生不定芽;通過愈傷組織培養誘導產生不定芽。試管快速繁殖應用在下列生產或研究中:(1)繁殖雜交育種中得到的少量雜交種,以及保存自交系、不育系等。(2)繁殖脫毒培養得到的少量無病毒苗(3)繁殖生產上急需的或種源較少的種苗。由于組織培養周期短,增殖率高及能全年生產等特點,加上培養材料和試管苗的小型化,這就可使有限的空間培養出大量的植物,在短期內培養出大量的幼苗。組織培養突出的優點是,通過這一方法在較短時期內迅速擴大植物的數量,以一個莖尖或一小塊葉片為基數,經組織培養一年內可增殖到10 000100 000株。


         植物脫毒:植物在生長過程中幾乎都要遭受到病毒病不同程度的危害,有的種類甚至同時受到數種病毒病的危害,尤其是很多園藝植物靠無性方法來增殖,若蒙受病毒病,代代相傳,越染越重,甚至會造成極嚴重的后果。自從Morell952年發現采用微莖尖培養方法可得到無病毒苗(virus free)后,微莖尖培養就成為解決病毒病危害的重要途徑之一。若再與熱處理相結合,則可提高脫毒培養的效果。對于木本植物,莖尖培養得到的植株難以發根生長,則可采用莖尖微體嫁接的方法來培育無病毒苗。組織培養無病毒苗的方法已在很多作物的常規生產上得到應用,如馬鈴薯,甘薯,草莓,蘋果,香石竹,菊花等。而且已有不少地區建立了無病毒苗的生產中心,這對于無病毒苗的培養、鑒定、繁殖、保存、利用和研究,形成了一個規范的系統程序,從而達到了保持園藝植物的優良種性和經濟性狀的目的。 


變異和培育:植物組織培養過程中往往存在大量的變異,這種變異稱為體細胞無性系變異。具有如下特點:一是變異的無方向性:既有有利的變異,也有有害的變異既有形態變異,也有生理變異。二是變異的普遍性:變異在組織培養中經常發生,出現在組織培養的各個時期。既有農藝性狀變異,又有經濟性狀變異;既有表型變異,又有生理變異。三是植物體細胞無性系變異的類型:一類為可遺傳變異,主要是由于遺傳物質的變化引起的(尤以基因突變為主)。四是引起植物體細胞無性系變異的原因:高濃度的GAIAA,會造成畸形胚的高頻發生,TDZ可使植株產生白化苗或玻璃化植株。五是植物體細胞無性系變異的利用價值及途徑,對于育種有重要的應用價值。 


單倍體育種:花藥、花粉的培養在蘋果、柑橘、葡萄、草莓、石刁柏、甜椒、甘藍、天竺葵等約20種園藝植物得到了單倍體植株。在常規育種中為得到純系材料要經過多代自交,而單倍體育種,經染色體加倍后可以迅速獲得純合的二倍體,大大縮短了育種的世代和年限。


種質資源保存用植物組織培養技術保存種質具有以下優點:在較小的空間內可以保存大量的種質資源。具有較高的繁殖系數。避免外界不利氣候及其他栽培因素的影響,可常年進行保存。不受昆蟲、病毒和其他病原體的影響。有利于國際間的種質交換與交流。

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